ウェスタンブロット（Western blot、WB）は、SDS-PAGEを行った後、抗体を用いて特定のタンパク質を検出する方法です。SDS-PAGE後のゲルから、電圧をかけて分離したタンパク質をメンブレンに転写させ、目的タンパク質に対する1次抗体と、HRP等の酵素で標識された2次抗体を順に反応させることで、特定のタンパク質を検出します。
サンプルの調製
タンパク質抽出後、BCA法またはBradford法を用いて濃度を測定します。
タンパク質濃度を決定した後、それぞれ等量の溶解液を分取し、4×SDS Sample Loading Bufferを添加します。
均一に混合した後、95〜100℃で5〜10分間加熱し、サンプルの還元および変性を行います。調製した溶解液は等量ずつ分注し、-20℃で保存します。
※注：一部の膜タンパク質や核タンパク質などは、熱処理によって凝集を生じやすく、電気泳動におけるバンドのシフトやシグナルの消失を引き起こす可能性があります。
SDS-PAGE電気泳動
1）等量のタンパク質サンプルおよびマーカーを、SDS-PAGEゲルのウェルにローディングします。細胞または組織溶解液の総タンパク質アプライ量は10〜40 μg、精製タンパク質は10〜100 ngが目安です。
2）80Vで20〜30分間泳動した後、電圧を120Vに調整してさらに1〜2時間泳動を続けます。BPBのバンドがゲルの最下部に達するまで泳動します（または目的タンパク質の分子量に合わせて泳動時間を調整してください）。
Tips
- 1）過硫酸アンモニウム（APS）は緩やかに分解するため、使用直前に調製してください；
- 2）電気泳動時、バンドのスマイリング現象（両側への拡散）を防ぐため、サンプルのない空のウェルには適量の1×ローディングバッファーを添加してください；
- 3）よりシャープなバンドを得るために、検出可能な範囲でアプライ量をできるだけ抑えることをお勧めします；
- 4）電気泳動時の発熱は、バンドのスマイリングやタンパク質の分解を引き起こすため、避けてください；
- 5）作製したゲルは、乾燥や凍結に注意すれば、4℃の冷蔵庫で約2〜4週間保存可能です。
転写（ウエット式の場合）
1）事前準備：PVDFメンブレンをメタノールに30秒間浸漬させます、転写膜をメタノールから取出し、精製水で2回軽くすすいだ後、1×転写バッファーに浸漬させます。ろ紙およびフォームパッドも同様に転写バッファーに浸します。
2）ゲルの回収：電気泳動槽からガラスプレートを取り外し、ゲルを傷つけないように回収して転写バッファーに浸漬させます。
3）陰極側から［フォームパッド ➔ ろ紙 ➔ ゲル ➔ メンブレン ➔ ろ紙 ➔ フォームパッド］の順に空気が入らないように乗せます。
4）200-300 mA定電流で90分間、または75V定電圧で90分間通電します。
5）転写が完了したら、PVDFメンブレンを取り出し、Ponceau S染色を行い、タンパク質が転写されていることを確認してください。
Tips
- 1）フォームパッドは使用後、毎回しっかり洗浄してください；
- 2）転写時間は目的タンパク質の分子量に応じて最適化が必要です、ウェット式で［75 V定電圧で80〜90分間］が条件検討の目安となります；
- 3）転写バッファーの再利用は最大2回までとしてください。繰り返しの使用は通電時の発熱を招き、タンパク質の分解を引き起こす原因となります；
- 4）高分子量タンパク質にはウェット式転写を推奨します。セミドライ式では、転写時間を延長しても転写効率が向上しないだけでなく、発熱によるタンパク質分解のリスクが高まります；
- プロテインマーカーと目的タンパク質の転写効率は必ずしも一致しないため、特にセミドライ式における高分子量タンパク質の転写には注意が必要です。
抗体反応
1. ブロッキング：5%のスキムミルクを用いて、室温で1時間ブロッキングを行うことをお勧めします。
2. 一次抗体インキュベーション：
1）膜をブロッキング液から取り出し、1× TBSTで3回（各5分間）洗浄します。
2）抗体の推奨希釈倍率に従い、一次抗体希釈液で希釈します。4℃で一晩反応させることをお勧めします。
3. 二次抗体インキュベーション：
1）1× TBSTで3回（各10分間）洗浄します。
2） 推奨倍率に希釈したHRP標識二次抗体を用い、室温で1時間反応させます。
検出
1）1× TBSTで4回（各10分間）洗浄します。
2）洗浄の間に、ECL基質A液とB液を1:1で等量混合し、検出液を調製します。
3）メンブレンにECL基質を反応させた後、ラップで包んでX線フィルムに露光させるか、または化学発光イメージャーで検出してください。
Tips
- 検出試薬（ECL）の選択は非常に重要であり、感度の異なる少なくとも2種類のECLを常備しておくことをお勧めします。検出液は使用直前に調製してください。
- 1）イメージャーで撮影時は「オート露光」を避け、連続撮影モード（5〜10枚）で最適な画像を選択することをお勧めします；
- 2）解像度や感度のパラメータを調整することで、画像の最適化が可能です。
初回撮影後の調整目安：
A. バンドが強すぎる場合：ECLを再塗布し、［高解像度・低感度］モードで再撮影します；
B. バンドが弱い場合：［低解像度・高感度］モードを試してください。
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