ウェスタンブロット（Western blot、WB）はイムノブロッティングとも呼ばれ、複雑なタンパク質混合物から特定のタンパク質を識別するための技術です。SDS-PAGE電気泳動によりタンパク質サンプルを分離し、電界作用を利用してタンパク質を固相担体（PVDF膜やニトロセルロース膜など）に転写し、抗原-抗体特異的結合および標識二次抗体による発色で標的タンパク質を検出します。
全工程操作ビデオ
実験操作手順
サンプル調製
タンパク質サンプル調製の流れを下図に示します：
タンパク質抽出が完了した後、BCA法またはBradford法で濃度を測定し、上样量を安定かつ制御可能にすることができます。
各種溶解液のタンパク質濃度を確定した後、等量の溶解液を採取し、4xSDS Sample Loading Bufferを添加します。
混合後、95-100°Cで5-10分間煮沸し、サンプルの還元および変性を行います。溶解液は等量に分注し、-20°Cで保存して備用することができます。
注意事項：一部の膜タンパク質や膜貫通タンパク質、さらには核タンパク質（Rbタンパク質）は、高温煮沸により凝集して<span style="color: red">多量体または「ゴーストバンド」</span>を形成し、電気泳動バンドの偏移や消失を引き起こす場合があります。
SDS-PAGE電気泳動
1）等量のタンパク質とタンパク質マーカーをSDS-PAGEゲルのウェルに上样します。細胞または組織溶解液の総タンパク質上样量は10-40 μg、精製タンパク質の上样量は10-100 ngです。
2）80Vで20-30分間泳動し、次に電圧を120Vに調整して1-2時間続けて泳動し、ブロモフェノールブルーのバンドがゲルの底部に到達するまで行います（または実際の分子量に応じて泳動時間を適宜調整します）。
Tips
- 1）過硫酸アンモニウムは徐々に分解するため、適時に新鮮に調製する必要があります；
- 2）電気泳動時には、タンパク質は上下方向に拡散分離するだけでなく、<span style="color: red">左右</span>方向にも拡散分離するため、サンプルのないウェルに適量の1x上样緩衝液（または無関係なタンパク質サンプル）を加え、「スマイリング」バンドの発生を防ぎます；
- 3）検出信号に影響を与えない前提下で、できるだけ少なく上样すると、結果のバンドがよりシャープになります；
- 4）電気泳動時に過熱しないでください、過熱はバンドの散在やタンパク質の分解を引き起こす可能性があります；
- 5）調製したゲルは、4℃の冷蔵庫で約2~4週間保存できます（乾燥防止、凍結融解防止）。
転写（ウェット転写を例として）
1）準備作業：PVDF膜をメタノールに30秒間浸漬し、純水で2回洗浄した後、1x電気転写緩衝液（ウェット転写）に浸漬します。濾紙とスポンジも転写液に浸漬します。
2）ゲルの取り外し：電気泳動槽からスライドを取り出し、ゲルを取り外して転写液に浸漬します。
3）「サンドイッチ」組み立て：スポンジ→濾紙→膜→ゲル→濾紙→スポンジの順に密着させて配置し、各層間に気泡がないように確保します。
4）定電流法（一般的に200-300 mA、90分）または定電圧法（一般的に75V、90分）で電気転写を行うことができます。
5）転写が完了したら、膜を取り出し、ポンソーSで染色して転写が成功したことを確認します。
Tips
- 1）毎回の転写後は、スポンジを彻底的に洗浄するようにしてください；濾紙はできるだけ再利用しないでください；
- 2）転写時間はタンパク質のサイズに応じて最適化する必要があり、20~250kDのウェット転写の参考定電圧は75V、80-90分です；
- 3）転写液は最大2回まで使用し、過剰な発熱によるタンパク質分解を避けてください；
- 4）高分子量のタンパク質にはウェット転写を推奨します、セミドライ転写は時間を延長しても転写効率が向上するとは限らず（分解を引き起こす可能性さえあります）；
- タンパク質マーカーと標的タンパク質の転写は完全には等価ではありません（セミドライ転写ではよく見られます）、特に高分子量のタンパク質において。
抗体インキュベーション
1. ブロッキング：推奨は5%スキムミルク（TBST中）で室温1時間インキュベーション。
2. 一次抗体インキュベーション：
1）膜をブロッキング液から取り出し、1x TBSTで3回洗浄し、毎回5分間。
2）抗体推奨希釈倍率に従って、一次抗体希釈液で一次抗体を希釈し、推奨は4°Cで一晩インキュベーション。
3. 二次抗体インキュベーション：
1）1x TBSTで膜を3回洗浄し、毎回10分間。
2）推奨希釈倍率のHRP結合二次抗体（ブロッキング緩衝液で希釈可能）を使用し、室温で1時間インキュベーション。
現像
1）1x TBSTで膜を4回洗浄し、毎回10分間。
2）洗浄中に、ECL基質A液とB液を1:1で混合して現像液を調製します。
3）ECL基質と膜を充分に反応させた後、ラップで膜を包み込み、暗箱に固定します。膜を暗室フィルムに暴露するか、化学発光イメージャーで信号を読み取ります。
Tips
- 現像液の選択も非常に重要で、実験室では少なくとも2種類の感度のECLを常備しておく必要があります。現像液は現用現調製を推奨し、初めて新しい標的を試す場合は、まず感度の低いECLを試し、弱い場合は高感度のECLに変えることをお勧めします。
- 1）イメージャーで撮影する際は、<span style="color: red">推奨しません</span>機械の<span style="color: red">自動露光</span>モードを使用すること；固定時間内に5枚または10枚撮影するモードを推奨し、後で実際の状況に応じて最適な画像を選択します；
- 2）イメージャーでは一般的に、画像のズーム、解像度/感度などのパラメータを調整することができます。
初回露光後に以下のような場合：
A. バンドが非常に強い場合、ECLを再添加した後、高解像度、低感度モードを選択することができます；
B. 逆に、バンドが少し弱い場合は、低解像度、高感度モードを試すこともできます。
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