酵素結合免疫吸着法（ELISA）操作プロトコル

ELISA実験を開始する前に、すべての試薬を室温に戻してください。試薬やサンプルの希釈時は、気泡が入らないよう注意しながら十分に混和させてください。

1. 抗体の固相化：実験の目的に応じ、コーティング用抗体を炭酸塩緩衝液（CBS）またはリン酸塩緩衝液（PBS）で適切な濃度に希釈します。各ウェルに100 μLずつ分注し、37℃で2時間、または4℃で一晩インキュベートします。

2. 洗浄：ウェル内の液体を吸引除去して液を切り、1×TBST（350 μL/ウェル）で2回洗浄します。各洗浄時は1〜2分間静置し、最後にプレートをペーパータオルの上で軽く叩いて完全に液を切ります。

3. ブロッキング：各ウェルにブロッキング液を200〜350 μL加え、37℃で1時間インキュベートします。

4. 洗浄：ステップ2と同様の操作を行います。

※注：市販のELISAキットは、通常あらかじめ抗体がプレートに固相化されているため、ステップ1〜4の操作は不要です。ご使用前に必ずご確認ください。

5. サンプルの添加：プレート上にブランク、標準品、測定サンプルの各ウェルを設定します。ブランクウェルにはサンプル希釈液を100 μL加え、その他のウェルには調製した標準品または測定サンプルを100 μLずつ加えます。プレートに蓋またはプレートシールを貼り、37℃で60〜120分間反応させます。データの信頼性を担保するため、標準品は毎回新しく調製したものをご使用ください。

※注：アプライの際は気泡が入らないよう注意し、チップの先がウェルの壁に触れないよう、各ウェルの底部に滴下してください。また、プレート1枚あたりのアプライ操作は10分以内に完了させてください。

6. 洗浄：ウェル内の液体を除去し、1×TBST（350 μL/ウェル）で4回洗浄します。各洗浄時は1〜2分間静置し、最後にプレートを軽く叩いて完全に液を切ります。

7. 検出抗体の添加：実験の目的に応じ、検出抗体を1×PBSで適切な濃度に希釈し、各ウェルに100 μLずつ加えて37℃で45分間インキュベートします。

8. 洗浄：ステップ6と同様の操作を行います。

9. 二次抗体の添加：実験の目的に応じ、二次抗体を1×PBSで適切な濃度に希釈し、各ウェルに100 μLずつ加えて37℃で30分間インキュベートします。

10. 洗浄：ステップ6と同様の操作を行います。

11. 発色反応：TMB発色基質液（A液とB液を1:1で均一に混合したもの）を各ウェルに100 μLずつ加え、37℃・遮光下で10分間インキュベートします。

12. 反応停止：各ウェルに1 M 硫酸溶液を100 μLずつ加え、発色反応を停止させます。

13. OD値の測定：測定波長450 nm（補正波長630 nm）にて各ウェルのOD値を測定します。反応停止液の添加後、5分以内に測定を行ってください。

14. 結果の解析：

1）各標準品および測定サンプルのOD値から、ブランクのOD値を差し引きます。

2）標準品の値から解析ソフトを用いて4パラメータ（4-PL）で検量線を作成します。得られた検量線からサンプルの濃度を算出し、希釈倍率を乗じて最終濃度とします。

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