酵素結合免疫吸着法（ELISA）操作手順

ELISA実験を開始する前に、すべての試薬を室温まで平衡化してください。試薬またはサンプルを希釈する際には、十分に混和すると同時に、泡の形成をできるだけ避けてください。

1. 抗体のコーティング：実験の必要性に応じて、炭酸塩緩衝液（CBS）またはリン酸緩衝液（PBS）でコーティング抗体を適切な希釈倍数に希釈し、100 μL/ウェルでコーティングし、37℃で2時間または4℃で一晩インキュベートします。

2. 洗板：ウェル内の液体を廃棄し、振り切り、1xTBSTで2回洗板し、毎回1-2分間浸漬し、350 μL/ウェル、振り切り（または軽くたたいてウェル内の液体を除去することもできます）。

3. ブロッキング：ウェルあたり200～350 μLのブロッキング液を添加し、37℃で1時間インキュベートします。

4. 洗板：ステップ2と同じです。

注：市販のキットでは、通常、コーティング抗体が予め酵素標識プレートにコーティングされているため、ステップ1-4は必要ありません。使用前に確認してください。

5. サンプルの添加：ゼロウェル、標準ウェル、被験サンプルウェルをそれぞれ設定します。ブランクウェルにはサンプル希釈液を100 μL添加し、残りのウェルには標準品または被験サンプルを100 μL添加します。酵素標識プレートに蓋またはフィルムをし、37℃で60-120分間反応させます。実験結果の有効性を保証するため、毎回の実験で新しい標準溶液を使用してください。

注：サンプルの添加中に気泡が発生しないようにしてください。サンプルは酵素標識プレートのウェル底部に添加し、できるだけウェル壁に触れないようにしてください。一枚のプレートのサンプル添加は10分以内に完了してください。

6. 洗板：ウェル内の液体を廃棄し、振り切り、1xTBSTで4回洗板し、毎回1-2分間浸漬し、350 μL/ウェル、振り切り（または軽くたたいてウェル内の液体を除去することもできます）。

7. 検出抗体の添加：実験の必要性に応じて、検出抗体を1xPBSで適切な希釈倍数に希釈し、100 μL/ウェルで添加し、37℃で45分間インキュベートします。

8. 洗板：ステップ6と同じです。

9. 二次抗体の添加：実験の必要性に応じて、二次抗体を1xPBSで適切な希釈倍数に希釈し、100 μL/ウェルで添加し、37℃で30分間インキュベートします。

10. 洗板：ステップ6と同じです。

11. 発色：TMB発色液A液とB液を1:1で十分に混合し、100 μL/ウェルで添加し、37℃で10分間インキュベートします。

12. 停止：1M硫酸溶液を100 μL/ウェルで添加し、発色を停止します。

13. マイクロプレートリーダーによる測定：630 nmを参照波長として、マイクロプレートリーダーで450 nmの波長で各ウェルの吸光度（OD値）を順次測定し、停止液を添加してから5分以内に測定してください。

14. 結果の判定：

1）各標準品およびサンプルのOD値は、ゼロウェルのOD値を引いたものとします。複製ウェルを設定した場合は、平均値を取得してください。

2）標準品の濃度を横軸に、OD値を縦軸にとり、Origin、ELISACalcなどの専門的な曲線作成ソフトウェアを使用して4パラメータフィッティング（4-PL）を行います。サンプルのOD値に基づいて、標準曲線から対応するフィッティング濃度を計算し、希釈倍率を掛けることでサンプルの測定濃度を得ます。

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