フローサイトメトリー（Flow Cytometry、FC）は、免疫学、ウイルス学、分子生物学、がん生物学など複数の分野に応用可能な強力なツールです。懸濁液中の単一細胞または他の生物学的粒子に標識された蛍光シグナルを検出し、各粒子の可視光散乱および蛍光パラメータを分析することで、単一細胞または生物学的粒子の定量分析と分離を行います。
I. 関連試薬の処方
| 名称 | 処方 |
|---|---|
| 1×PBS | 10 mM PBS、室温放置、有効期間7日。 |
| 固定液 | 4% PFAまたは100%メタノールまたは80%メタノール、-20°Cで保存、有効期間12ヶ月。 |
| 細胞保存液 | 0.1% ProclinTM 300を含む1×PBS、2~8°Cで保存、有効期間3ヶ月。 |
| 透過液 | 1×Permeabilization Buffer（eBioscience）または90%メタノール、使用直前に調製。 |
| ブロッキング液 | 1% BSA、2.26%グリシン、10%陰性ヤギ血清、0.1% Tween-20および0.05% ProclinTM 300を含む1×PBS、2~8°Cで保存、有効期間1ヶ月。 |
II. 細胞の固定
1)細胞室から細胞を取得し、96ウェルプレートで、1ウェルあたりの細胞数は5x105~1x106個にする必要があります。取得した細胞を1500 rpm/minで5分間遠心し、上清を廃棄します。
2)固定液4% PFAを加え、室温で15分間固定します。または氷冷メタノールを加え、15分間固定します。
3)固定液を除去し、1×PBSで室温で2回洗浄し、毎回5分間。
4)1×PBSを除去し、細胞保存液を加え、2~8°Cで保存します。
III. 透過処理とブロッキング
固定ステップでメタノールなどの有機溶媒固定液を使用した場合、透過処理ステップは不要です。過度な透過処理は細胞構造を破壊し、シグナル損失を引き起こすため、濃度と時間を厳密に制御する必要があります。
1)透過液を加え、室温で10分間インキュベートします。
2)透過液を除去し、十分なブロッキング液を加え、室温で15分間インキュベートします。
IV. 抗体のインキュベーション
1)説明書に従って1×PBSで一次抗体を希釈します。
2)ブロッキングした細胞を混和し、96ウェルV字型プレートに移し、1500 rpm/minで5分間遠心し、上清を廃棄し、希釈した一次抗体を加え、よく混和し、室温で15分間インキュベートします。
3)一次抗体を除去し、1×PBSを加え、室温で1回洗浄します。
4)1×PBSを除去し、蛍光二次抗体を加え、よく混和し、室温で暗所で15分間インキュベートします。
5)二次抗体を除去し、1×PBSを加えて室温で2回洗浄し、毎回5分間。
6)1×PBSを加えて細胞を再懸濁し、フローサイトメーターで検出します。
プロトコルダウンロード
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