フローサイトメトリー（Flow Cytometry、FC）は、多数の細胞や微粒子を流体で1列に並べてレーザー光を照射することにより、単一細胞レベルでの定量解析やソーティングを可能にする技術です。免疫学、ウイルス学、分子生物学、がん研究など、多岐にわたる分野で強力な解析ツールとして応用されています。
I. 関連試薬の組成・調製
| 名称 | 組成 |
|---|---|
| 1×PBS | 10 mM PBS（室温保存、有効期限：7日間）。 |
| 固定液 | 4% PFA、100%メタノール、または80%メタノール（-20°C保存、有効期限：12ヶ月）。 |
| 細胞保存液 | 0.1% ProclinTM 300含有1×PBS（2〜8°C保存、有効期限：3ヶ月）。 |
| 透過液 | 0.1% Tween-20または90%メタノール（※用時調製）。 |
| ブロッキング液 | 1% BSA、2.26%グリシン、10%正常山羊血清、0.1% Tween-20、0.05% ProclinTM 300含有1×PBS（2〜8°C保存、有効期限：1ヶ月）。 |
II. 細胞固定
1) 培養細胞を回収し、96ウェルプレートの1ウェルあたり5×105〜1×106 cellsになるよう調製します。回収した細胞を1,500 rpmで5分間遠心分離し、上清を吸引除去します。
2) 固定液として4% PFA、または氷冷したメタノールを加え、室温で15分間固定します。
3)固定液を除去し、1×PBSを用いて室温で各5分間、計2回洗浄します。
4)1×PBSを除去後、細胞保存液を加え、2〜8°Cで保存します。
III. 透過処理およびブロッキング
メタノールなどの有機溶媒による固定を行った場合は、透過処理は不要です。過度な透過処理は細胞構造を破壊しシグナル消失の原因となるため、濃度と処理時間にご注意ください。
1)透過液を加え、室温で10分間インキュベートします。
2) 透過液を除去し、十分な量のブロッキング液を加え、室温で15分間インキュベートします。
IV. 抗体反応
1) 抗体希釈液を用いて一次抗体を最適な濃度に希釈します。
2)ブロッキング後の細胞を懸濁して96ウェルV底プレートに移し、1,500 rpmで5分間遠心分離します。上清を除去した後、調製した一次抗体液を加えて、室温で15分間インキュベートします。
3)一次抗体を除去し、1×PBSを加えて室温で1回洗浄します。
4) 1×PBSを除去後、蛍光標識二次抗体を加え、室温・遮光下で15分間インキュベートします。
5) 二次抗体液を除去し、1×PBSを用いて室温で各5分間、計2回洗浄します。
6) 1×PBSで細胞を再懸濁し、フローサイトメーターにセットして測定を行います。
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