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免疫沈降法（Immunoprecipitation、IP）およびその派生技術である共免疫沈降法（Co-immunoprecipitation、Co-IP）は、抗原-抗体特異的相互作用に基づく生物化学のコア技術であり、複雑な溶解液から特定の標的タンパク質とその直接または間接的に相互作用する分子複合体を選択的に濃縮・精製するために使用されます。この技術システムのコアは、抗体を固相基質（アガロースまたは磁気ビーズなど）に固定し、「アフィニティー精製」の原理により、数千のタンパク質背景から標的抗原を効率的に捕捉し、後続の定性、定量、機能解析に使用することです。

研究材料に適した標準操作手順を選択して細胞または組織の溶解を行うことができます。また、HUABIO公式ウェブサイトの「ウェスタンブロット」操作におけるサンプル溶解の操作を参照することもできます。

（1）高濃度の界面活性剤は免疫沈降効果を妨げます。そのため、まずRIPAで細胞または組織を溶解してタンパク質溶解液を調製し、免疫沈降ステップを開始する際に、1xTBSまたはIPインキュベーションバッファーを添加して必要な体積に希釈することができます。

（2）十分なタンパク質溶解物を使用してください：単管IP実験では、溶解物の初期タンパク質量は1-3mgを推奨します。

（3）溶解液にプロテアーゼ阻害剤が添加されていることを確認してください。プロテアーゼ阻害剤の使用量は、通常のWB実験のサンプル調製の1.5-2倍にすることができます。

実験アプリケーション

免疫沈降法（IP）操作手順

1. 適量の溶解液をEPチューブ（低吸着）に入れ、同時に1-4μgの抗体を加え、1xTBSまたはIPインキュベーションバッファーで1mLの体積に調整します。最適な抗体量は抗体価によって決定されるべきです。別に等量の溶解液を取り、等量の1xTBSまたはIPインキュベーションバッファーと等量の同型IgGをControl IgG対照群として加えます。

2. すべてのEPチューブを回転ラックに置き、4℃で2-4時間または一晩回転させます。

3. 20-50μlの再懸濁したProtein Aアガロースビーズまたは磁気ビーズを加え、4℃で1-2時間回転させながらインキュベートします。

4. 4℃、500gで30秒遠心し、上清を廃棄します。または磁気スタンドに置いて1分間静置します。

5. プロテアーゼ阻害剤を含む1mLの1×TBSを加えて沈殿複合体を洗浄し、4℃、500gで30秒遠心（または磁気スタンドに置いて1分間静置）し、上清を吸引して廃棄します；4-5回繰り返し洗浄します。最後の洗浄/遠心後、EPチューブに約80μlの溶液を残します（残りはすべて廃棄）。

6. 20μlの5x SDS-PAGEタンパク質ローディングバッファーを加え、IP複合体ビーズを再懸濁し、95-100℃で5分間煮沸した後、8,000-10,000gで3分間遠心し、上清を注意深く吸引して新しいEPチューブに移します。

7. 回収したIPサンプルをSDS-PAGEの対応するレーンに加え、残りのIPサンプルは-80℃で保存して後で使用することができます。

8. SDS-PAGEによりIPサンプルを分離し、タンパク質をPVDF膜に転写し、適切な抗体を使用して後続の検出を行います。

注：IPサンプルのWB検出を行う場合、サンプル中の抗体重鎖および軽鎖の干渉を排除または低減するために、IP二次抗体（HUABIO Catalog# NBI01H（ウサギ）およびCatalog# NBI02H（マウス）など）を使用して検出することができます。