実験操作プロトコル

1.サンプルの前処理

切片の乾燥：パラフィン切片または凍結切片を65℃のオーブンに入れて一晩（＜16時間）乾燥させます。

脱パラフィンおよび再水和：

a）脱パラフィン：パラフィン切片をキシレン1、2、3に順次、各5分間浸します。続いて、パラフィン切片を無水エタノール1、2、3、95%エタノール、85%エタノール、75%エタノールの順に各3分間浸します。最後に純水で3回（各3分間）洗浄します。

b）再水和：切片を室温（21〜25℃）に戻した後、PBSで3回（各2分間）洗浄します。

抗原賦活化：賦活化が必要な場合は、以下のいずれかの方法で行います（サンプルの状態に応じて賦活化を行わない選択も可能です）

マイクロウェーブによる賦活化：1×クエン酸緩衝液（pH 6.0）に入れた切片を電子レンジで沸騰させ（約3分間）、室温で30分間冷却します。

内因性PODのブロッキング：内因性PODブロッキング剤を滴下し、常温・遮光下で10分間反応させた後、PBSで3回（各2分間）洗浄します。

2.一回目の染色サイクル

一次抗体反応：

組織切片が完全に覆われるように一次抗体をのせて、28℃±2℃・遮光下で20〜30分間反応させます。

PBSで3回（各2分間）洗浄します。

二次抗体反応：

組織切片が完全に覆われるように標識二次抗体をのせて、28℃±2℃・遮光下で20〜30分間反応させます。

PBSで3回（各2分間）洗浄します。

TSA発色反応：

TSA DiluentとPBSを1:299の比率で混合し、3回転倒混和してTSA Diluent希釈液を調製します。

Cyclic-480を上記のTSA Diluent希釈液で1:250〜1:500の比率になるよう希釈します。

組織切片が完全に覆われるように希釈したCyclic-480を滴下し、常温・遮光下で5〜10分間反応させます。

PBSで3回（各2分間）洗浄します。

光学顕微鏡で陽性反応を観察します、シグナルが確認できたら、次の染色へと進みます。

抗体溶出（必要に応じて、以下のいずれかの方法を選択してください）：

a）高温溶出：

［Citrate Antigen Retrieving Buffer］と純水を1:49の比率で希釈して混和します。

電子レンジで3±1分間加熱します。試薬から細かい気泡が出始めたら、95℃ウォーターバスに移し、10〜15分間静置します。

シェーカーにのせ、常温で自然冷却します。

PBSで3回（各2分間）洗浄します。

b）温和な溶出：

60℃に予熱した［1× Ab Stripping Buffer］を滴下し、28℃±2℃・遮光下で10〜20分間反応させます。

PBSで3回（各2分間）洗浄します。

※注：本方法は、ストリッピング後に使用する抗体の由来種が、それまでに使用した抗体の由来種と異なる場合のみ適用可能です（ただし、高温ストリッピングによって既に除去された抗体は除きます）。

3. 2回目の染色サイクル

1回目の染色サイクルと同様に操作します。

4. 3回目の染色サイクル

1回目の染色サイクルと同様に操作します。

5.核染色

[DAPI]をPBSで1:49に希釈します。

切片が完全に覆われるように希釈した[DAPI]を滴下し、常温・遮光下で5分間反応させます。

PBSで3回（各2分間）洗浄します。

光学顕微鏡でシグナルが確認できたら、封入します。

6.封入

［Mounting Medium］を1滴滴下し、気泡が入らないように封入します。

7.顕微鏡イメージング

蛍光顕微鏡/共焦点/蛍光スキャナー/多スペクトルイメージングシステム等で画像を取得します。

波長の設定は下表を参照してください。

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