多重免疫蛍光法（mIHC）操作手順

1.サンプル前処理

切片の焼き付け：パラフィン/凍結切片を65℃に設定したオーブンに一晩（＜16時間）焼き付けます。

切片の再水和：

a）パラフィン切片の脱ろうから水まで：切片をキシレン-1、キシレン-1'、キシレン-1"を入れた染色缸に順次入れ、各5分間浸漬します。続いて、無水エタノール-1、無水エタノール-1'、無水エタノール-1"、95%エタノール、85%エタノール、75%エタノールを入れた染色缸に順次入れ、各3分間浸漬します。最後に、精製水を入れた染色缸に入れ、精製水を順次交換して3回洗浄し、毎回3分間。

b）凍結切片の再水和：凍結切片を室温（21~25℃）に戻した後、PBS溶液を入れた染色缸に入れ、PBS溶液を順次交換して3回洗浄し、毎回2分間。

抗原賦活化：必要に応じて、以下の2つの修復方法を使用できます（サンプルの状況に応じて修復しないことも選択できます）

マイクロ波修復：透明なビーカーに適量の1×クエン酸（PH6.0）緩衝液（切片数に応じて調整）を加え、組織切片を入れてマイクロ波オーブンに入れ、強火で沸騰するまで加熱し、約3分間；室温で30分間冷却した後、水道水で流水洗浄して室温まで冷却します。

内因性ペルオキシダーゼのブロッキング：免疫組織化学ペンで組織の周囲に耐水サークルを描き、後で添加する試薬が組織を完全かつ均一に覆い、乾燥を防ぐようにします。耐水サークルを描いた切片を湿箱に平らに置き、適量の内因性カタラーゼブロッカーを加えて組織を完全かつ均一に覆い、室温で暗所にて10分間インキュベートします。切片をPBS溶液を入れた染色缸に入れ、PBS溶液を順次交換して3回洗浄し、毎回2分間。

2.最初のマーカー染色

一次抗体インキュベーション：

調製した一次抗体希釈液で抗体を各一次抗体に対応する濃度に希釈した後、切片を表向きに湿箱に平らに置き、適量の希釈した一次抗体を加えて組織を完全かつ均一に覆い、28℃±2℃で暗所にて振盪しながら20-30分間インキュベートします。

切片をPBS溶液を入れた染色缸に入れ、PBS溶液を順次交換して3回洗浄し、毎回2分間。

二次抗体インキュベーション：

一次抗体の種に応じて、対応する種の[TSA-HRP（R）]または[TSA-HRP（M）]を選択し、切片を表向きに湿箱に平らに置き、適量の[TSA-HRP（R）]または[TSA-HRP（M）]を加えて組織を完全かつ均一に覆い、28℃±2℃で暗所にて振盪しながら20-30分間インキュベートします。

切片をPBS溶液を入れた染色缸に入れ、PBS溶液を順次交換して3回洗浄し、毎回2分間。

TSA発色反応：

[TSA Diluent]：PBS溶液を1:299の割合で希釈し、上下に3回程度混ぜてTSA Diluent希釈液を得ます。

続いて、Cyclic-480：TSA Diluent希釈液を1:250-1:500の割合で希釈します。

切片を表向きに湿箱に平らに置き、適量の希釈したCyclic-480を加えて組織を完全かつ均一に覆い、室温で暗所にて5-10分間インキュベートします。

切片をPBS溶液を入れた染色缸に入れ、PBS溶液を順次交換して3回洗浄し、毎回2分間。

蛍光顕微鏡で特異的染色があるかどうかを観察し、特異的染色を確認した後、次のマーカー染色を行います。

抗体溶出（ニーズに応じて、以下の2つの方法のいずれかを選択してください）：

a）高温溶出：

[Citrate Antigen Retrieving Buffer]：精製水を1:49の割合で希釈し、混和してから染色缸に注ぎます。

切片を染色缸に入れ、マイクロ波オーブンで最大出力で3±1分間加熱し、染色缸の試薬に小さな気泡が出たら、事前に95℃に予熱した恒温水浴槽に移し、95℃以上で10-15分間保持します。

染色缸を取り出して振とう機に置き、室温まで自然冷却します。

切片をPBS溶液を入れた染色缸に入れ、PBS溶液を順次交換して3回洗浄し、毎回2分間。

b）温和な溶出：

切片を表向きに湿箱に平らに置き、適量の60℃に予熱した[1x Ab Stripping Buffer]を加えて組織を完全かつ均一に覆い、28℃±2℃で暗所にて10-20分間インキュベートします。

切片をPBS溶液を入れた染色缸に入れ、PBS溶液を順次交換して3回洗浄し、毎回2分間。

注：この方法は、溶出後に標識された抗体が以前に標識された抗体と異なる種起源の場合にのみ適しています（高温溶出ステップ前に標識された抗体を含みません）。

3.2番目のマーカー染色

最初のマーカーと同じ操作を行い、蛍光分子を[Cyclic-550]に交換し、[Cyclic-550]を[TSA Diluent希釈液]で1:250-1:500の割合で希釈し、発色時間を5-10分間とします。

4.3番目のマーカー染色

最初のマーカーと同じ操作を行い、蛍光分子を[Cyclic-630]に交換し、[Cyclic-630]：[TSA Diluent希釈液]を1:100-1:250の割合で希釈し、発色時間を10-15分間とします。

5.核染色

[DAPI]：PBS溶液を1:49の割合で希釈します。

切片を表向きに湿箱に平らに置き、適量の希釈した[DAPI]を加えて組織を完全かつ均一に覆い、室温で暗所にて5分間インキュベートします。

切片をPBS溶液を入れた染色缸に入れ、PBS溶液を順次交換して3回洗浄し、毎回2分間。

蛍光顕微鏡で特異的染色があるかどうかを観察し、特異的染色を確認した後、封入を行います。

6.封入

ゴム製のピペットで[Mounting Medium]を吸い、一滴の[Mounting Medium]を加えて組織を完全かつ均一に覆い、適切なサイズの清潔なカバーガラスをピンセットで持ち、気泡を避けて組織を軽く覆います。

7.顕微鏡イメージング

切片を蛍光顕微鏡/共焦点/マルチチャネル蛍光スキャナー/マルチスペクトルイメージングシステムの下に置き、画像を観察および収集します。

イメージング波長設定は以下の表を参照してください。

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