細胞免疫蛍光法（IF-cell）操作プロトコル

1.関連試薬の調製

2.細胞固定

1）接着細胞は細胞密度が50〜70%程度、浮遊細胞は一般に1×10⁶ cells/mLの密度を目安とし、培地を除去します。

2）1×PBS（常温）で1回洗浄します。

3）4% PFA固定液（常温）で15分間、または冷メタノールで3〜5分間固定します。

4）1×PBS（常温）で3回（各5分間）洗浄します。

3.透過処理およびブロッキング

メタノールなどの有機溶媒による固定を行った場合は、透過処理は不要です。過度な透過処理は細胞構造を破壊しシグナル消失の原因となるため、濃度と処理時間にご注意ください。

1）透過液を加え、室温で15分間インキュベートします。

2）1×PBSTで2回（各5分間、常温）洗浄します。

3）適量のブロッキング液を加え、常温で1時間インキュベートします。

4.抗体反応

1）抗体希釈液を用いて一次抗体を最適な濃度に希釈します。

2）希釈した一次抗体を加え、2〜8℃で一晩インキュベートします。

3）一次抗体を除去し、1×PBSTを加え、シェーカー（常温）で3回（各5分間）洗浄します。

4）蛍光標識二次抗体を加え、常温・遮光下で45分間インキュベートします。

5）二次抗体を除去し、1×PBSTを加え、シェーカー（常温）で3回（各5分間）洗浄します。

6）封入し、遮光下で保存します。

組織免疫蛍光法（IF-tissue）操作プロトコル

※注：非特異的染色の原因となるため、全工程を通じて切片が乾燥しないようにしてください

1.パラフィン切片の脱パラフィンおよび親水化

染色の前に、試薬を浸透させるための脱パラフィン処理を行います。

2.手順

1）キシレンⅠ 10分間；

2）キシレンⅡ 10分間；

3）キシレンⅢ 10分間；

4）無水エタノールⅠ 3分間；

5）無水エタノールⅡ 3分間；

6）95%エタノール 3分間；

7）流水で3分間すすぐ。

3.抗原賦活化処理

目的の抗原に応じて最適な賦活化方法を選択し、処理後に透過処理およびブロッキングを行います。

1）熱水加熱による賦活化：適量の1×Tris-EDTA緩衝液（pH 9.0）またはクエン酸緩衝液（pH 6.0）を容器に入れ、電子レンジで沸騰させます。沸騰後、組織切片を入れ、90〜95℃で20分間加熱します。その後、室温で10分間自然冷却し、流水で室温まで冷却します。

2）高圧熱処理による賦活化：適量の1×クエン酸緩衝液（pH 6.0）を入れたオートクレーブを蓋をせずに沸騰させ、組織切片を入れます。その後、蓋を閉めて一定の圧力がかかってから2分間維持します。加熱後、室温で10分間自然冷却し、圧力が完全に下がってから蓋を開け、流水で室温まで冷却します。

*本方法は、検出が困難な抗原や核内抗原の賦活化に推奨されます。

3）電子レンジによる賦活化：適量の1×Tris-EDTA緩衝液（pH 9.0）を電子レンジで沸騰させます。そこに組織切片を入れ、95〜100℃で20分間加熱します。その後、室温で10分間自然冷却し、流水で室温まで冷却します。

*抗原賦活化を行う理由：ホルマリンやパラホルムアルデヒド固定によって、タンパク質間に架橋が形成され、エピトープが遮蔽されます。抗原賦活化処理を行うことで、抗原を露出させ、抗体と結合できるようにします。

4. 透過処理およびブロッキング

ブロッキング液（10%山羊血清＋0.3M グリシン＋0.25% Triton X-100含有1×TBST）を滴下し、常温で30分間インキュベートします。

5. 一次抗体反応

希釈した一次抗体を加え、4℃で一晩インキュベートします（翌日、冷蔵庫から取り出した後は室温に30分間置いてから以降の操作を行ってください）。

*直接法(一次抗体に直接、蛍光色素や酵素を標識)で検出する場合は、本ステップの終了後にそのまま封入操作へ進むことができます。

6.二次抗体反応

蛍光標識二次抗体を加え、常温で1〜2時間インキュベートします。

7.封入

1×TBSTで3回（各3分間）洗浄し、封入します。

凍結切片IHC-Fr実験操作プロトコル

1. 組織固定

灌流固定：あらかじめ氷冷した生理食塩水またはPBSで脱血した後、4%パラホルムアルデヒド（PFA）固定液で固定を行います。

浸漬固定：目的の組織10〜20倍量の4% PFA液に浸漬します。

固定条件：4℃で一晩（18時間）固定します。

2.ショ糖脱水

組織のトリミング：固定後、PBS中で組織を適切な大きさと形状にトリミングします。

脱水処理：組織を10倍量以上の15%ショ糖溶液に移し、4℃で組織が沈降するまで（約8時間または一晩）脱水します。次いで、10倍量以上の30%ショ糖溶液に移し、4℃で組織が完全に沈降するまで（約1〜2日間）脱水します。

3. O.C.T. コンパウンド包埋

包埋皿の作製：アルミホイルを2〜3重に折り畳み、液漏れのない適切な大きさの包埋皿を作製します。脳などの組織では、包埋皿にA（Anterior：前）、P（Posterior：後）およびサンプル番号を必ず明記してください。

組織の処理：組織を取り出し、清潔なろ紙で表面の水分を完全に拭き取ります（O.C.T.との接触面を乾燥させることが重要です）。

4.切片の作製

装置の予冷：クライオスタットを起動し、温度を-20℃に設定して予冷します。

パーツの予冷：新しい替刃とアンチロールプレートを装着し、十分に冷やします。これにより、温度差による切片の付着やカールの発生を防ぎます。

組織ブロックの固定および温度調節：少量のO.C.T.を滴下して「接着剤」とします。包埋皿から取り出した凍結組織ブロックを迅速にのせます。

粗削りおよび薄切：刃先を組織に近づけ、厚さ20〜50 μmで組織の面が出るまで粗削りを行います。その後、目的の厚さ（例：10 μm）に設定を変更し、薄切を行います。

切片の回収および保存：コーティングスライドガラスを薄切片に軽く押し当て、切片を水平に吸着させます。-20℃で短期（約1ヶ月）、-80℃で長期（最低1年間）保存可能です。

5. 切片の復温

室温で30分間静置します。

6.抗原賦活化処理

急速凍結切片や短時間のPFA固定サンプルでは、通常、抗原賦活化は不要です。エピトープが著しく遮蔽されている場合のみ、一次抗体のデータシートや文献に従って適切な賦活化処理を選択してください。

7.透過処理およびブロッキング

疎水性囲いの作製：組織の周囲（約0.5 cm離したところ）に囲いを描きます。これにより液体の飛散を防ぎ、サンプルの乾燥を防止します。

ブロッキング液の調製（50 mL処方例）：1×TBSまたは1×TBST（45 mL）、二次抗体と同種の血清（5 mL）、グリシン（1.125 g、約0.3 M）、Triton X-100（50〜500 μL、終濃度0.1〜1%）を十分に混匀します。

ブロッキング反応：疎水性囲にブロッキング液を滴下し、常温で30分間インキュベートします。

8.一次抗体反応

1）ピペットでブロッキング液を除去します（洗浄は不要）。

2）希釈した一次抗体を100 μL滴下します。

3）4℃で一晩（12〜16時間）インキュベートします。

4）常温に30分間静置します。

5）1×TBST緩衝液で3回（各3分間）洗浄します。

9. 蛍光標識二次抗体反応

1）洗浄液を軽く拭き取ります（組織表面は乾燥させず、液溜まりがない状態にします）。

2）希釈した蛍光標識二次抗体を100 μL滴下します。

3）室温で1～2時間インキュベートします。

4）1×TBST緩衝液で3回（各3分間）洗浄します。

10. DAPI染色および封入

1）最終洗浄の後、余分な水分を軽く拭き取ります（組織の乾燥を防ぐため、1〜2分以内に封入操作を行ってください）。

2）組織の上にDAPI入り封入剤を滴下します。

3）気泡が入らないよう封入します。

4）長期保存する場合は、封入剤の蒸発を防ぐため、カバーガラスの周囲をマニキュア等でシールします。

11. 画像取得

免疫蛍光の結果を記録します。

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