IF-cell細胞免疫蛍光操作ビデオ

細胞免疫蛍光法（IF-cell）操作手順

1.関連試薬処方

2.細胞固定

1）接着細胞の形態が正常で、細胞密度が50%～70%程度に達した場合、または浮遊細胞の密度が一般的に1×10⁶の場合、細胞培養培地を除去します。

2）室温で1×PBSを1回洗浄します。

3）1×PBSを除去し、固定液4% PFAを加えて室温で15分間固定します。または氷冷メタノールを加えて3~5分間固定します。

4）室温で1×PBSを3回洗浄し、毎回5分間。

3.透過とブロッキング

固定ステップでメタノールなどの有機溶媒固定液を使用した場合は、透過ステップは必要ありません。過度の透過は細胞構造を破壊し、シグナルの損失を引き起こす可能性があるため、濃度と時間を厳密に制御する必要があります。

1）透過液を加えて室温で15分間インキュベートします。

2）透過液を除去し、1×PBSTを加えて室温で2回洗浄し、毎回5分間。

3）十分なブロッキング液を加えて室温で1時間インキュベートします。

4.抗体インキュベーション

1）説明書に従って抗体希釈液で一次抗体を希釈します。

2）ブロッキング液を除去し、希釈した一次抗体を加えて細胞を覆い、2~8℃で一晩インキュベートします。

3）一次抗体を除去し、1×PBSTを加えて水平振盪機上で室温で3回洗浄し、毎回5分間。

4）PBSTを除去し、蛍光二次抗体を加えて室温で暗所にて45分間インキュベートします。

5）二次抗体を除去し、1×PBSTを加えて水平振盪機上で室温で3回洗浄し、毎回5分間。

6）DAPIを含む抗蛍光退色剤で封入し、暗所で保存します。

組織免疫蛍光法（IF-tissue）操作手順

注意：操作全体の間、切片は湿潤環境（湿箱）に保ち、乾燥を避けてください。乾燥すると非特異的染色が発生しやすくなります。

1.パラフィン切片の脱ろうから水まで

パラフィン切片を染色する前に、脱ろう処理が必要です。そうすることで、切片が正常に染色されます。

2.手順

1）キシレンⅠ 10分間；

2）キシレンⅡ 10分間；

3）キシレンⅢ 10分間；

4）無水エタノールⅠ 3分間；

5）無水エタノールⅡ 3分間；

6）95%エタノール 3分間；

7）流水で3分間すすぐ。

3.パラフィン切片の抗原賦活化

修復方法は抗原に応じて調整でき、修復後に透過とブロッキングを行います。

1）水煮修復：高温容器に適量の1×Tris-EDTA（pH9.0）/クエン酸（PH6.0）緩衝液を加え、電磁調理器で3-5分間沸騰させて弱火で気泡がないことを確認します；組織切片を容器に入れ、電磁調理器を弱火に調整して90-95℃で20分間維持し、蓋をします。室温で10分間冷却した後、水道水で流水洗浄して室温まで冷却します。（骨など剥離しやすい組織の場合は、60℃で一晩修復することができます。）

2）高圧修復：圧力鍋に適量の1×クエン酸（pH6.0）緩衝液を加え、蓋をせずに沸騰するまで加熱し、組織切片を圧力鍋に入れ、バルブを取り付けて均一に蒸気が出るまで加熱し、2分間維持し、室温で10分間冷却した後、圧力バルブが落下したら圧力鍋の蓋を開け、流水で洗浄して室温まで冷却します。

*この方法は、検出が困難な抗原または核抗原の抗原賦活化に適しています。

3）マイクロ波修復：透明なビーカーに適量の1×Tris-EDTA（PH9.0）緩衝液を加え、電子レンジに入れて強火で沸騰するまで加熱し；組織切片を入れ、電子レンジを弱火に調整して95-100℃で20分間維持します（溶液が切片を覆っているか、切片に気泡がないかを途中で確認してください）。室温で10分間冷却した後、水道水で流水洗浄して室温まで冷却します。

*抗原賦活化の理由：ホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドで固定する過程で、組織内の一部の抗原はタンパク質間の架橋とアルデヒド基の閉塞を起こし、抗原活性を失います。抗原賦活化により、細胞内の抗原決定基を再び露出させ、抗原検出の成功率を向上させることができます。

4. 透過とブロッキング

切片を少し乾かした後、組織の周りに組織化学ペンで円を描き、円内にブロッキング液（1×TBSTで調製した10%ヤギ血清+ 0.3Mグリシン+0.25% Triton X-100）を滴下し、湿箱に入れて室温で30分間透過とブロッキングを行います。

5. 一次抗体インキュベーション

ブロッキング液を吸引除去し、円内に1×TBSTで希釈した一次抗体を滴下します（通常100 μL/グループ）。切片を湿箱に平らに置き、4℃で一晩インキュベートします（4℃冷蔵庫から取り出した後、室温で30分間放置してから後続の実験操作を行ってください）。

*直接標識一次抗体で検出する場合は、このステップの後に封入することができます。

6.二次抗体インキュベーション

スライドを1×TBSTで3回洗浄し、毎回3分間。切片を軽く叩いて乾かした後、円内に予め1×TBSTで希釈した蛍光標識ヤギ抗マウス/ウサギIgG（DAPI 1:10000またはHoechst 33258を含む）100 μLを滴下して組織を覆い、室温で1-2時間インキュベートします。

7.封入

スライドを1×TBSTで3回洗浄し、毎回3分間。洗浄後、抗蛍光退色封入剤で封入します（封入時に組織に気泡ができないように注意してください、写真撮影に影響を与えます）。

凍結切片IHC-Fr実験操作手順

1. 組織固定

灌流固定：心臓灌流により、まず予冷した生理食塩水またはPBSを迅速に注入して血液を洗い流し、次に十分な予冷した4%パラホルムアルデヒド（PFA）固定液を灌流します。

採材と浸漬固定：目標組織を迅速に解剖し、10-20倍量の4% PFAに浸漬します。

固定条件：4℃冷蔵庫に入れて一晩固定します（18時間）。

2.ショ糖脱水

組織の修整：固定後、PBS中で組織を適切なサイズと形状に簡単にトリミングします。

グラジエント脱水：まず組織を少なくとも10倍量の15%ショ糖溶液（1×PBSで調製）に移し、4℃で組織が底に沈むまで脱水します（約8時間または一晩）。次に少なくとも10倍量の30%ショ糖溶液（1×PBSで調製）に移し、4℃で組織が底に沈むまで脱水します（約1～2日）。

3.OCT包埋

モールドの作製：2-3層のアルミホイルを適切なサイズの四角形モールドに折りたたみ、漏れがないようにします。方向の要求がある組織（脳など）の場合は、モールドにA（Anterior、前）、P（Posterior、後）およびサンプル番号を明確に標記してください。

組織処理：組織をショ糖溶液から取り出し、清潔なろ紙で表面の液体を軽くかつ徹底的に吸い取り、OCTと接触するすべての面が完全に乾燥していることを確認します。

4.切片作製

システムの前平衡：凍結ミクロトームを起動し、キャビネット温度とサンプルヘッド温度を共に-20℃に設定します。この温度は最適化された平衡点であり、水分の多い生体組織とOCTが、柔らかすぎず（ナイフにくっつき）、脆すぎない（破損しやすい）理想的な硬度に達することができます。必要に応じて、実際の状況に応じて-15℃～-25℃に調整することができます。

コンポーネントの予冷：新しいまたは鋭いブレードを取り付け、アンチロールプレートを取り付けます。コンポーネントと環境の温度差による切片の接着または異常なカールを防止するため、キャビネット温度と十分に平衡させます。

組織ブロックの固定と復温：サンプルホルダーに少量のOCTを「接着剤」として滴下します。モールドから取り出した凍結組織ブロックを迅速にサンプルホルダーに接着し、切片機の凍結ステージに置いてしっかり固定します。

ブロックトリミングと切片作製：ナイフホルダーを調整して、ブレードの刃先と組織ブロックの切断面との距離を約1mmに保ちます。切片の厚さを20～50 μmに設定し、粗修整ハンドルを迅速に回して最大かつ完全な組織切断面が出るまで修整します。厚さを目標の厚さ（例えば10 μm）に調整して、正式な切片作製を行います。ハンドルの回転は安定かつ均一に保ちます。

マウントと保存：接着スライドを使用して切り出した組織切片を軽く押し、スライドに平らに吸着させます。すぐにスライドに明確で一意なサンプル情報を標記します。-20℃で短期間（約1ヶ月）保存可能；-80℃で長期間（少なくとも1年）抗原活性を保存できます。

5.切片復温

凍結切片を-80℃冷蔵庫から取り出し、室温に平らに置き、30分間復温します。

6.抗原賦活化

ほとんどの免疫蛍光実験（特に急速凍結切片または短時間パラホルムアルデヒド固定のサンプル）では、通常、抗原賦活化は必要ありません。抗原エピトープが重度に遮蔽されている場合は、一次抗体の説明書または関連文献に従って適切な修復方法を選択してください。修復しない場合は、直接透過とブロッキングステップに進むことができます。

7.透過とブロッキング

疎水円の描画：免疫組織化学専用油性ペンで組織の周りに円を描き、円の縁と組織の縁との距離を約0.5 cmに保ち、液体の範囲を限定してサンプルの乾燥を防止します。

ブロッキング液の調製（50 mL処方）：45 mL 1×TBSまたは1×TBST 5 mL 二次抗体と相同な正常血清 1.125 g グリシン（約0.3 M） 50～500 μL Triton X-100（終濃度0.1～1%、抗原の局在によって異なり、核局在の標的は濃度を高くする） よく混ぜて使用します。

ブロッキングインキュベーション：疎水円内にブロッキング液を滴下し、組織を完全に覆います。切片を湿箱に水平に入れて室温で30分間インキュベートします。

8.一次抗体インキュベーション

1）ブロッキング液を軽く振り落とすかピペットで吸引除去します（洗浄不要）。

2）説明書に従って希釈した一次抗体作業液を適量（約100 μL）滴下し、組織を均一に覆います。

3）切片を湿箱に入れて4℃で一晩（12～16時間）インキュベートします。

4）翌日、湿箱を取り出して室温で30分間復温します。

5）1×TBST緩衝液で3回洗浄し、毎回3分間。

9. 蛍光標識二次抗体インキュベーション

1）切片上の洗浄液を軽く叩いて乾かし、組織表面を湿らせたままにしますが、液溜まりがないようにします。

2）推奨される希釈倍率で希釈した蛍光標識二次抗体作業液を適量（約100 μL）滴下します。

3）切片を遮光湿箱に入れて室温で1～2時間インキュベートします。

4）1×TBST緩衝液で3回洗浄し、毎回3分間。

10. DAPI染色/封入

1）最後の洗浄が完了したら、余分な液体を軽く吸引除去し、組織が完全に乾燥するのを避けます。封入操作は1～2分以内に完了する必要があります。

2）組織にDAPIを含む抗蛍光退色封入剤を一滴加えます。サンプルが事前にDAPI染色されている場合は、DAPIを含まない封入剤を使用することができます。

3）ピンセットでカバーガラスの片側を持ち、一端からゆっくりと覆い、気泡が発生しないようにします。

4）長期保存する場合は、中性樹脂または透明なマニキュアでカバーガラスの縁を密封し、封入剤の蒸発を防ぎます。

11. 写真撮影

免疫蛍光結果を客観的かつ正確に記録し、定量分析のための信頼できるデータを提供します。

プロトコルダウンロード

https://huabio.cn/resources?category=Protocol

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