IHC全工程操作ビデオ

パラフィン切片IHC-P実験操作手順

1.脱ろうから水まで

パラフィン切片を染色する前に、脱ろう処理が必要です。そうすることで、切片が正常に染色されます。

1）キシレンⅠ 10分間；

2）キシレンⅡ 10分間；

3）キシレンⅢ 10分間；

4）無水エタノールⅠ 3分間；

5）無水エタノールⅡ 3分間；

6）95%エタノール 3分間；

7）流水で3分間すすぐ。

2.抗原賦活化

一般的に使用される抗原賦活化方法には、高圧修復、水煮修復、酵素修復があります；一般的に使用される修復溶液には、クエン酸溶液（pH 6.0）、EDTA溶液（pH 9.0）、Tris-EDTA（pH 9.0）、トリプシン、ペプシンなどがあります。

1）水煮修復：高温容器に適量の1×Tris-EDTA（pH9.0）/クエン酸（PH6.0）緩衝液を加え、電磁調理器で3-5分間沸騰させて弱火で気泡がないことを確認します；組織切片を容器に入れ、電磁調理器を弱火に調整して90-95℃で20分間維持し、蓋をします。室温で10分間冷却した後、水道水で流水洗浄して室温まで冷却します。（骨など剥離しやすい組織の場合は、60℃で一晩修復することができます。）

2）高圧修復：圧力鍋に適量の1×クエン酸（pH6.0）緩衝液を加え、蓋をせずに沸騰するまで加熱し、組織切片を圧力鍋に入れ、バルブを取り付けて均一に蒸気が出るまで加熱し、2分間維持し、室温で10分間冷却した後、圧力バルブが落下したら圧力鍋の蓋を開け、流水で洗浄して室温まで冷却します。

注：この方法は、検出が困難な抗原または核抗原の抗原賦活化に適しています。

3）酵素修復：切片を少し乾かした後、ろ紙で組織周囲の水を拭き取り、組織化学ペンで組織の周りに円を描き（抗体の流出を防止するため、組織化学ペンの先端に水が付かないように注意し、描く円は適切な大きさにして、組織から約0.5cm離してください）、円内にトリプシン作業液を滴下して組織を覆い、切片を湿箱に平らに置いて室温で20分間インキュベートし、蒸留水で3回浸漬洗浄し、毎回3分間。

注：抗原賦活化の理由：ホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドで固定する過程で、組織内の一部の抗原はタンパク質間の架橋とアルデヒド基の閉塞を起こし、抗原活性を失います。抗原賦活化により、細胞内の抗原決定基を再び露出させ、抗原検出の成功率を向上させることができます。

3.免疫組織化学染色

1）切片を純水で3回洗浄し、毎回5分間。

2）ブロッキング：切片を3%過酸化水素水溶液に入れて10分間インキュベートします。

注：ブロッキングの理由：組織中の顆粒球、単球、赤血球などには内在性ペルオキシダーゼが存在し、これらの酵素は西洋ワサビペルオキシダーゼと同様に、発色剤DAB、AECと反応して偽陽性を引き起こす可能性があります。内在性ペルオキシダーゼを除去する方法は、過酸化水素溶液でブロッキングすることです。

3）切片を純水で2回洗浄し、毎回5分間。

4）切片を少し乾かした後、ろ紙で組織切片周囲の水を拭き取り、組織化学ペンで組織の周りに円を描き、円内に1%BSAで調製した10%陰性ヤギ血清を滴下して組織を覆い、室温で1時間ブロッキングします。

5）ブロッキング液を除去し、次に推奨される抗体希釈液で希釈した一次抗体を各切片に加え（通常100μL/組織）、湿箱中で室温で1時間インキュベートします。

6）抗体溶液を除去し、1×TBSTで3回浸漬洗浄し、毎回5分間。

7）切片を軽く叩いて乾かした後、円内にヤギ抗ウサギまたはマウス二次抗体（HA1119またはHA1120）を滴下して組織を覆い、湿箱中で室温で20分間インキュベートします。

*HA1119（HRP Conjugated Goat anti-Rabbit IgG UltraPolymer Goat Polyclonal Antibody）

*HA1120（HRP Conjugated Goat anti-Mouse IgG UltraPolymer Goat Polyclonal Antibody）

8）1×TBSTで3回浸漬洗浄し、毎回5分間。

9）DAB発色：切片を軽く叩いて乾かした後、円内に新しく調製したDAB発色液を滴下し、顕微鏡下で発色時間を制御します。陽性は茶色が黄色で、陽性信号が出現するか5分間発色するまで観察し、水道水を入れた洗浄ボトルまたはDAB専用ビーカーでスライドをすすいで発色を停止し、水道水で5-10分間流水洗浄します。

注：DAB試薬には潜在的な変異原性があります。調製と発色時には二重手袋を着用して防護してください。DAB発色後は専用の洗浄ビーカーを使用し、他のビーカーと混ぜて使用しないでください。

4.複染と脱水

1）ヘマトキシリン 10分間；

2）流水で3分間すすぐ；

3）青化剤 1分間；

4）流水で3分間すすぐ；

5）95%エタノールⅠ 1分間；

6）95%エタノールⅡ 1分間；

7）95%エタノールⅢ 1分間；

8）無水エタノールⅠ 1分間；

9）無水エタノールⅡ 1分間；

10）キシレンⅠ 1分間；

11）キシレンⅡ 1分間；

12）オーブン65℃ 2分間。

*試薬は定期的に交換する必要があり、青化液が変色した場合は事前に交換してください。

5.封入

中性ゴムで封入します。

注：操作全体の間、切片は湿潤環境に保ち、乾燥を避けてください。乾燥すると非特異的染色が発生しやすくなります。

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