1. 脱パラフィン及び親水処理

パラフィン切片の染色前に、試薬を浸透させるための脱パラフィン処理を行います。

1）キシレン1：10分間；

2）キシレン2：10分間；

3）キシレン3：10分間；

4）無水エタノール1：3分間；

5）無水エタノール2：3分間；

6）95%エタノール 3分間；

7）流水洗浄 3分間。

2.抗原賦活化処理

主な抗原賦活化法には熱誘導抗原賦活法、酵素処理があります。一般的な賦活化液には、クエン酸緩衝液（pH 6.0）、EDTA溶液（pH 9.0）、Tris-EDTA（pH 9.0）、トリプシン、ペプシンなどを用います。

1）熱水加熱による賦活化：適量の1×Tris-EDTA緩衝液（pH 9.0）またはクエン酸緩衝液（pH 6.0）を容器に入れ、電子レンジで沸騰させます。沸騰後、組織切片を入れ、90〜95℃で20分間加熱します。その後、室温で10分間自然冷却し、流水で室温まで冷却します。

2）高圧熱処理による賦活化：適量の1×クエン酸緩衝液（pH 6.0）を入れたオートクレーブを蓋をせずに沸騰させ、組織切片を入れます。その後、蓋を閉めて一定の圧力がかかってから2分間維持します。加熱後、室温で10分間自然冷却し、圧力が完全に下がってから蓋を開け、流水で室温まで冷却します。

*本方法は、検出が困難な抗原や核内抗原の賦活化に推奨されます。

3）酵素による賦活化：組織の周囲（約0.5 cm離したところ）に囲いを描きます。これにより抗体の流出を防ぎます。トリプシンワーキングソリューションを滴下して、室温で20分間インキュベートします。その後、蒸留水に各3分間、計3回浸漬して洗浄します。

※注：抗原賦活化を行う理由：ホルマリンやパラホルムアルデヒド固定によって、タンパク質間に架橋が形成され、エピトープが遮蔽されます。抗原賦活化処理を行うことで、抗原を露出させ、抗体と結合できるようにします。

3.染色

1）純水で各5分間、計3回洗浄します。

2）内因性PODブロッキング：切片を3%過酸化水素水溶液に浸漬し、10分間インキュベートします。

※注：ブロッキングの理由：組織内の顆粒球、単球、赤血球には内因性ペルオキシダーゼが含まれています。これらは二次抗体のHRPと同様に、発色剤であるDABやAECと反応して偽陽性を引き起こすため、過酸化水素水による事前のブロッキングが必要です。

3）純水で各5分間、計2回洗浄します。

4）1%BSAを含むブロッキング液を組織上に滴下し、室温で1時間ブロッキングします。

5）ブロッキング液を除去し、一次抗体を滴下して室温で1時間インキュベートします。

6）抗体液を除去し、1×TBSTで各5分間、計3回洗浄します。

7）二次抗体（山羊抗ウサギ/マウス HRP標識ポリマー：HA1119またはHA1120）を滴下して組織を覆い、室温で20分間インキュベートします。

*HA1119（HRP Conjugated Goat anti-Rabbit IgG UltraPolymer Goat Polyclonal Antibody）

*HA1120（HRP Conjugated Goat anti-Mouse IgG UltraPolymer Goat Polyclonal Antibody）

8）1×TBSTで各5分間、計3回洗浄します。

9）DAB発色：DAB発色液を滴下し、顕微鏡下で発色状況を観察します（陽性は茶褐色）。シグナルを確認後（目安として最長5分）、すぐに反応を停止させ、その後、流水で5〜10分間水洗します。

※注：DAB試薬には潜在的な変異原性があります。調製および発色時は手袋を二重に着用するなどの防護を行い、使用後はDAB専用の廃棄用ビーカーを使用してください（他の容器との混用不可）。

4. 対比染色および脱水

1）ヘマトキシリン 10分間；

2）流水洗浄 3分間；

3）色出し 1分間；

4）流水洗浄 3分間；

5）95%エタノール1 1分間；

6）95%エタノール2 1分間；

7）95%エタノール3 1分間；

8）無水エタノール1 1分間；

9）無水エタノール2 1分間；

10）キシレン1 1分間；

11）キシレン2 1分間；

12）オーブン65℃ 2分間。

*各試薬は定期的に交換してください。色出し液の色調が変わった場合は早めに交換します。

5.封入

封入剤で封入します。

※注：非特異的染色の原因となるため、全工程を通じて切片が乾燥しないようにしてください。

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