サンプルの調製

最適な結果を得るために、一回の免疫沈降につき約4×10⁶個の細胞が必要です（ポジティブおよびネガティブコントロールを含め、少なくとも計12×10⁶個の細胞をご用意ください）。

1. 架橋反応：タンパク質とDNAを架橋させるため、15 cmディッシュに37%ホルムアルデヒド540 µlを添加します（培地20 mL）。浮遊細胞の場合は、20 mLの培地に浮遊させた状態で同量のホルムアルデヒドを添加します（最適な固定を行うため、細胞密度は0.5×10⁶cells/ml未満に調整してください）。緩やかに混和後、室温のシェーカー上で10分間インキュベートします（ホルムアルデヒドの最終濃度は1%）。添加後、培地の色が変化します。

2. 架橋反応の停止：2 mLの10×グリシン溶液（最終濃度0.125 M）を添加して反応を停止させ、室温で5分間インキュベートします。グリシンの添加により培地の色がさらに変化します。

3. 細胞の回収（接着細胞の場合）：培地を吸引除去し、氷冷した1×PBSで細胞を2回洗浄します（各洗浄時にPBSを完全に除去してください）。その後、氷冷した1×PBS（プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む）5 mLを加え、セルスクレーパーを用いて細胞を脱落させ、15 mLチューブに回収します。4℃、1,000×gで5分間遠心分離し、上清を棄却します。

4. 細胞の回収（浮遊細胞の場合）：、細胞を50 mL遠心チューブに移し、4℃、500×gで5分間遠心分離します。ペレット（沈殿）を氷冷した1×PBSで2回洗浄し、上清を棄却します。

5. 細胞の溶解：ChIPライシスバッファー（1×10⁷個あたり1mL）を加え、氷上で10分間インキュベートします。この段階のサンプルは、-80℃で最大3ヶ月間保存可能です。

クロマチンの断片化

1. 超音波処理：超音波処理により、ゲノムDNAを断片化し、断片サイズを200〜1,000 bp（400〜800 bpの範囲に集中させることがより理想的）に調整します。処理時間は細胞株に応じて最適化する必要があります。

※注：

1）条件検討の目安（中国Scientz社製の超音波発生装置を使用する場）：直径2 mmのマイクロプローブを使用し、振幅20%（出力130W相当）、5秒間On / 15秒間Offの間欠処理にて、超音波処理時間を2、4、8、12、16分間の設定で行います。

2）細胞種による条件差と注意点：細胞の種類によって最適な条件は異なるため、必ず予備実験を行ってください。再現性を保つため、毎回のサンプル容量および細胞数は一定に固定してください。また、処理中はサンプルが常に氷冷され、低温が維持されていることを確認してください。プローブの先端がチューブの底や壁面に接触しないように調整してください。

3）バッファー組成および細胞密度の影響：SDS濃度、塩強度、または界面活性剤濃度が高くなるほど、DNAは断片化されやすくなります。逆に、細胞密度が高すぎる場合は断片化しにくくなります。腫瘍細胞と比較して、初代培養細胞（プライマリーセル）や組織由来の細胞はクロマチンの破砕が困難な傾向にあります。特にT細胞などは、細胞体が非常に小さく緻密であるため、通常の条件では破砕しきれないことが多く、最適な結果を得るためには可溶化バッファーの変更やソニケーション条件の再検討が必要です。

2. 4℃、8,000×gで10分間遠心分離し、上清を新しいEPチューブに回収します。

DNA濃度および断片サイズの測定

1. 200 µLのクロマチンサンプルに5 M NaClを8 µL添加し、65℃で一晩インキュベートします。

2. プロテイナーゼK（20 mg/mL）を1 µL添加し、42℃で1時間インキュベートします。

3. PCR精製キットを用いてDNAを精製します。

4. 1.5%アガロースゲル電気泳動を行い、DNAの断片サイズを確認します。

免疫沈降

1. 超音波処理条件を最適化した後、サンプルに対して超音波処理を行います。

2. プロテアーゼ阻害剤を含むChIP Dilution Bufferを調製します（プロテアーゼ阻害剤：ChIP Dilution Buffer=1:100）。超音波処理済みのサンプル100 µLを分取し、プロテアーゼ阻害剤を含むChIP Dilution Buffer 900 µLを加え、最終容量を1 mLとします。

3. 20 µL（2%）のサンプルをInputとして分取し、-20℃で保存します。同時に、ポジティブコントロールおよびアイソタイプ対照を設定します。

4. サンプルに1次抗体を2〜5 µg加え、ローテーターで一晩（少なくとも4時間以上）4℃で攪拌します。

5. Protein A/G Magnetic Beads / Salmon Sperm DNAを40 µL加え、4℃で60分間攪拌します。

※注：Protein A/G磁気ビーズをそのまま使用することも可能ですが、非特異的結合に対して感度が高いアプリケーションでは、ChIP反応系にブロッキング剤を添加することができます。ブロッキング剤：2.5µg/µL BSA、2.5µg/µLサケ精子DNA（最終濃度）。

6. 磁力スタンドに1分間静置して分離させ、上清を捨てます。この際、ビーズに触れないようご注意ください。続いて、以下の溶液を用いてビーズを洗浄します。各洗浄液の使用量は1 mLとし、毎回4℃で3〜5分間洗浄した後、磁気スタンドに1分間静置して、上清を捨てます。ビーズには触れないようご注意ください。

1）Low Salt Immune Complex Wash Bufferで1回洗浄します。

2）High Salt Immune Complex Wash Bufferで1回洗浄します。

3）LiCl Immune Complex Wash Bufferで1回洗浄します。

4）TE Bufferで2回洗浄します。

溶出および架橋結合の切断

1. 適量のElution buffer（1% SDS、0.1M NaHCO3）を新しく調製します。

2. すべての洗浄ステップが完了した後、Elution buffer 150µLを加えます。

3. サンプルを65°Cで30分間（振幅300rpm）インキュベートし、クロマチンをビーズから溶出させます。

4. 10,000 × gで10秒間遠心分離し、チューブのフタに付着した残液を回収します。

5. チューブを磁気スタンドに60秒間静置して分離させ、上清を新しいチューブに移します。

6. すべてのチューブに、5M NaClを6 µL、およびプロテアーゼK（20 mg/mL）を2 µL加えます。その後、65℃で2時間または一晩加熱し、タンパク質とゲノムDNAのクロスリンクを切断します。

DNA精製および解析

1. 150 µLのサンプルを使用し、DNA精製キットの取扱説明書に従って操作を行います。

2. PCRによる検出および解析を行います。