クロマチン免疫沈降法（Chromatin Immunoprecipitation、ChIP）は、生体内でタンパク質とゲノムDNAの特定領域との相互作用を研究するための重要なエピゲネティクス技術です。その核心原理は：生細胞状態で化学架橋によりタンパク質-DNA複合体を固定し、次にクロマチンをランダムに断片化し、抗原-抗体特異的反応を利用して、免疫沈降により標的タンパク質に結合したDNA断片を濃縮し、最終的に精製DNAの定性的または定量的分析により、ゲノム上のタンパク質の正確な結合部位、結合強度、および動的調節パターンを決定することです。この技術は「タンパク質-遺伝子機能関連研究」から「タンパク質-ゲノム定位実証」へのパラダイムシフトを実現し、転写調節、クロマチン修飾、および3次元ゲノム構造を解析するための基本的ツールとなっています。
サンプル調製
最適なChIP結果を得るために、免疫沈降ごとに約4×10<sup>6</sup>個の細胞を使用してください（陽性対照および陰性対照を含めて、少なくとも12×10<sup>6</sup>個の細胞が必要です）。
1. タンパク質とDNAを架橋するために、15cm培養ディッシュに540µlの37%ホルムアルデヒド（20mL培地）を添加します。浮遊細胞の場合は、20mL培地に浮遊させた細胞に540µlの37%ホルムアルデヒドを添加します（浮遊細胞の最適な固定のために、固定時の細胞密度は0.5×10<sup>6</sup>個の細胞/ml未満にする必要があります）。軽く混和し、室温で振とう培養10分間インキュベートします。ホルムアルデヒドの最終濃度は1%です。ホルムアルデヒド添加後、培地の色変化が見られます。
2. 2mlの10xグリシン（最終濃度0.125M）を添加して反応を停止させ、室温で5分間インキュベートします。グリシン添加により培地の色変化が生じます。
3. 接着細胞の場合は、培地を廃棄し、氷冷1x PBSで細胞を2回洗浄し、毎回培養ディッシュから洗浄液を完全に除去します。5mLの氷冷1x PBS（プロテアーゼ阻害剤混合物含有）を添加し、細胞スクレーパーで細胞をかき取り、15mLチューブに移します。4°C、1000gで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。
4. 浮遊細胞の場合は、細胞を50mL遠心チューブに移し、4°C、500gで5分間遠心分離し、氷冷1x PBSで沈殿を2回洗浄し、上清を廃棄します。
5. ChIP溶解緩衝液（1×10<sup>7</sup>個の細胞あたり1mL）を添加し、氷上で10分間インキュベートします。または、サンプルを-80°Cで最大3か月間一時的に保存することもできます。
クロマチン超音波破砕
1. 超音波処理によりゲノムDNAを切断し、DNA断片の大部分を200-1000bpにし、できれば大部分を400-800bpに制御するのが望ましいです。このステップは最適化が必要で、細胞株によって超音波処理時間が異なります。
注：
1）接触式プローブ新芝超音波装置の探索条件：2mm直径のマイクロプローブ、振幅20%（出力130W）、5秒間超音波処理、15秒間休止、超音波処理時間グラジエントを2、4、8、12、16分間に設定します。HeLa細胞の場合、2分間で良好なクロマチン断片化サンプルを得ることができます。
2）細胞によって超音波処理条件が異なるため、前実験が必要です。超音波処理の体積と細胞用量は毎回固定する必要があり、そうでないと後続の実験に相対的に固定された超音波処理条件を使用することができません。超音波処理中は、サンプルが氷浴中にあり、低温に保たれていることを確認してください。プローブが超音波処理チューブの底部や壁に接触しないようにしてください。超音波処理中に泡沫が発生した場合は、超音波処理を一時停止し、超音波処理チューブの位置を調整してください。
3）超音波処理バッファーについて：SDS濃度が高いほどDNAは切断されやすくなります；塩イオンまたは界面活性剤濃度が高いほどDNAは切断されやすくなります；細胞密度が高いほどDNAは切断されにくくなります；一般的な腫瘍細胞株と比較して、多くの初代細胞や組織細胞のクロマチン超音波破砕はより困難で、例えばT細胞は非常に小さく密な細胞であるため、超音波処理が難しい場合が多いです。この場合は、異なる溶解および超音波処理条件が必要で、架橋反応時間を5分間に短縮することができます。
2. 4°C、8,000gで10分間遠心分離して細胞デブリを沈殿させ、上清を新しいEPチューブに移します。
DNA濃度および断片サイズの測定
1. 8µLの5M NaClを200µLのクロマチンに添加し、65°Cで振とう培養して一晩インキュベートします。
2. 1µLのプロテイナーゼK（20mg/mL）を添加し、42°Cで振とう培養して1時間インキュベートします。
3. PCR精製キットを使用してDNAを精製します。
4. 1.5%アガロースゲル電気泳動によりDNA断片サイズを決定します。
免疫沈降
1. 超音波処理条件を最適化した後、サンプルを超音波処理します。
2. プロテアーゼ阻害剤を含む適量のChIP Dilution Buffer（プロテアーゼ阻害剤：ChIP Dilution Buffer=1:100）を調製します。100µlの超音波処理サンプルを取り、900µlのプロテアーゼ阻害剤を含むChIP Dilution Bufferを添加し、最終体積を1mLにします。
3. 20µL（2%）のサンプルをInputとして取り出し、-20°Cで保存し、後続の検出に使用します。陽性対照および同型対照（陰性対照）も同時に設定します。
4. サンプルに2—5µgの一次抗体を添加し、4°Cで一晩または少なくとも4時間以上ゆっくり回転させます。
5. さらに40µLのProtein A/G Magnetic Beads/Salmon Sperm DNAを添加し、4°Cで60分間ゆっくり回転させ、一次抗体が認識するタンパク質または対応する複合体を沈殿させます。
注：Protein A/G磁気ビーズを直接使用することができます。非特異的結合に高度に敏感なアプリケーションでは、ChIP反応にブロッキング試薬を添加することができます。ブロッキング試薬：2.5µg/µL BSA、2.5µg/µLサケ精子DNA（終濃度）。
6. 磁力スタンドに置いて1分間分離し、上清を除去します。ビーズに触れないでください。以下の溶液を順番に使用してビーズを洗浄し、毎回の洗浄液量は1mLで、毎回4°Cで3—5分間ゆっくり回転または振盪洗浄した後、磁力スタンドに置いて1分間分離し、上清を注意深く除去します。ビーズに触れないでください。
1）Low Salt Immune Complex Wash Bufferで1回洗浄します。
2）High Salt Immune Complex Wash Bufferで1回洗浄します。
3）LiCl Immune Complex Wash Bufferで1回洗浄します。
4）TE Bufferで2回洗浄します。
溶出と架橋解除
1. 適量のElution buffer（1% SDS、0.1M NaHCO3）を新しく調製します。
2. すべての洗浄ステップが完了した後、150µLのElution bufferを添加します。
3. サンプルを振盪機能付きのメタルバスに置き、65°Cで30分間（振幅300rpm）インキュベートし、ビーズからクロマチンを溶出します。
4. 10,000gで10秒間遠心分離し、遠心管の蓋に残留するサンプルを回収します。
5. 遠心管を磁力スタンドに置いて60秒間分離し、上清を新しい遠心管に移し、それぞれラベルを付けます。
6. すべてのチューブ（Inputチューブを含む。各Inputサンプルに150µLのElution bufferを添加）に、6µLの5M NaClと2µLのプロテイナーゼK（20mg/mL）を添加し、65°Cで2時間または一晩加熱して、タンパク質とゲノムDNAの間の架橋を除去します。
DNA精製と分析
1. 150µLのサンプルをDNA精製キットの説明書に従って処理します。
2. PCR検出および分析を行います。
プロトコルダウンロード
https://huabio.cn/resources?category=Protocol製品推奨
染色质免疫沉淀检测试剂盒ChIP Assay Kit (Protein A/G磁珠)
染色质免疫沉淀检测试剂盒ChIP Assay Kit (Protein A/G磁珠)
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